Биология

Биология - Проточная цитометрия

08 февраля 2011





Проточная цитометрия

Проточная цитометрия является современной технологией быстрого оптического измерения параметров клетки, ее органелл и происходящих в ней процессов.

Методика заключается в выявлении рассеяния света лазерного луча при прохождении через него клетки в струе жидкости, причём, степень световой дисперсии позволяет получить представление о размерах и структуре клетки. Кроме того, в ходе анализа учитывается уровень флуоресценции химических соединений, входящих в состав клетки или внесённых в образец перед проведением проточной цитометрии.

Образцы для проточной цитометрии

• кровь
• костный мозг
• ликвор
• суставная жидкость
• плевральная жидкость
• асцитическая жидкость
• суспензированные клетки тканей

Принцип метода

Клеточная суспензия, предварительно меченная флюоресцирующими моноклональными антителами или флуоресцентными красителями, попадает в поток жидкости, проходящий через проточную ячейку. Условия подобраны таким образом, что клетки выстраиваются друг за другом за счет т. н. гидродинамического фокусирования струи в струе. В момент пересечения клеткой лазерного луча детекторы фиксируют:

• рассеяние света под малыми углами.
• рассеяние света под углом 90°.
• интенсивность флуоресценции по нескольким каналам флуоресцентности- позволяет определить субпопуляционный состав клеточной суспензии и др.

Наиболее часто используемые флуорохромы

• Флуоресцеина изотиоцианат
• Фикоэритрин
• Перидинин-Хлорофилл Протеин
• Алофикоцианин

Тандемные красители:

• Фикоэритрин — Техасский красный
• Фикоэритрин — Cy5
• Фикоэритрин — Cy7
• Аллофикоцианин- Cy7

"Квантовые точки" QD560, QD590 и т.д.

Преимущества метода

• короткое время анализа за счет высокой скорости
• анализ большого количества клеток
• логические ограничения допускают детектирование субпопуляций клеток
• измерение параметров редко встречающихся клеток
• объективное измерение интенсивности флуоресценции

Область применения

Иммунология

• иммунофенотипирование клеток периферической крови
• определение фагоцитарной активности
• определение внутриклеточных цитокинов
• определение внутриклеточных белков, например транскрипционных факторов GATA-3, T-bet, FoxP3 для дискриминации CD4 Т-лимфоцитов
• определение пролиферативной активности
• исследование клеточного цикла
• оценка клеточной цитотоксичности

Онкология

• количественный анализ внутриклеточных компонентов
• анализ стадий клеточного цикла
• выявление анеуплоидного клона
• определение пролиферативной активности анеуплоидного клона
• определение специфических маркеров
• позволяет проводить наблюдение пациентов, входящих в группу риска
• оценка состояния иммунной системы:
• оценка клеточного звена иммунитета
• оценка функциональной состоятельности иммунокомпетентных клеток

Цитология

• определение цитоморфологической принадлежности клетки размер, соотношение ядро/цитоплазма, степень асимметричности и гранулярности клеток
• оценка активности внутриклеточных ферментов с помощью флуорогенных субстратов
• определение экспрессии поверхностных антигенов
• анализ стадий клеточного цикла
• измерение физиологических параметров клетки

Гематология

• анализ субпопуляционного состава клеток периферической крови
• подсчет ретикулоцитов, анализ тромбоцитов по специфическим маркерам
• дифференциальная диагностика лимфопролиферативных заболеваний и реактивных лимфоцитозов
• диагностика лимфопролиферативных заболеваний
• диагностика острых лейкозов
• оценка минимальной резидуальной болезни

Фармакология

• измерение экспрессии маркеров
• измерение активности внутриклеточных ферментов
• определений стадий клеточного цикла в рамках изучения механизмов воздействия различных биологически активных веществ на клеточном уровне

В настоящее время проточная цитометрия применяется для выявления определённых клеток в исследуемых образцах, определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам, а также мониторирования состояния вирусного процесса у ВИЧ-инфицированных пациентов.

Выявление бактериальных, грибковых, а также собственных клеток организма в биологических жидкостях крайне важно для диагностики многих заболеваний. В ходе одного из исследований было показано, что проточная цитометрия обладает в 100—1000 раз более высокой чувствительностью по сравнению с микроскопией и позволяет выявлять бактериальные клетки в количестве 10-100 в 1 мл крови. При более низкой концентрации бактерий в образце возможно проведение предварительной инкубации. Высокую чувствительность методу придает использование моноклональных антител, помеченных флуоресцирующим веществом.

Проточная цитометрия позволяет не только выявлять инфицирование микроорганизмами, но и определять спектр их чувствительности, причём, длительность исследования не превышает нескольких часов. Подвергнутые воздействию антибиотиков микроорганизмы сравнивают с контрольными образцами того же штамма для установления их жизнеспособности, а также изменений в нуклеиновых кислотах, белках, оболочке клеток и т. п., что позволяет оценить как степень эффекта антибиотика, так и точку приложения его действия.

Ещё одной областью применения проточной цитометрии является мониторирование состояния вирусного процесса у ВИЧ-инфицированных лиц путём определения абсолютного количества CD4+ клеток и их доли в популяции лимфоцитов. Методика может также использоваться для контроля эффективности проводимой терапии.

Просмотров: 11991

<<< Опыты Г. Шапошникова по искусственной эволюции