Биология - Проточная цитометрия
08 февраля 2011Проточная цитометрия
Проточная цитометрия является современной технологией быстрого оптического измерения параметров клетки, ее органелл и происходящих в ней процессов.
Методика заключается в выявлении рассеяния света лазерного луча при прохождении через него клетки в струе жидкости, причём, степень световой дисперсии позволяет получить представление о размерах и структуре клетки. Кроме того, в ходе анализа учитывается уровень флуоресценции химических соединений, входящих в состав клетки или внесённых в образец перед проведением проточной цитометрии.
Образцы для проточной цитометрии
- кровь
- костный мозг
- ликвор
- суставная жидкость
- плевральная жидкость
- асцитическая жидкость
- суспензированные клетки тканей
Принцип метода
Клеточная суспензия, предварительно меченная флюоресцирующими моноклональными антителами или флуоресцентными красителями, попадает в поток жидкости, проходящий через проточную ячейку. Условия подобраны таким образом, что клетки выстраиваются друг за другом за счет т. н. гидродинамического фокусирования струи в струе. В момент пересечения клеткой лазерного луча детекторы фиксируют:
- рассеяние света под малыми углами.
- рассеяние света под углом 90°.
- интенсивность флуоресценции по нескольким каналам флуоресцентности- позволяет определить субпопуляционный состав клеточной суспензии и др.
Наиболее часто используемые флуорохромы
- Флуоресцеина изотиоцианат
- Фикоэритрин
- Перидинин-Хлорофилл Протеин
- Алофикоцианин
Тандемные красители:
- Фикоэритрин — Техасский красный
- Фикоэритрин Cy5
- Фикоэритрин Cy7
- Аллофикоцианин- Cy7
"Квантовые точки" QD560, QD590 и т.д.
Преимущества метода
- короткое время анализа за счет высокой скорости
- анализ большого количества клеток
- логические ограничения допускают детектирование субпопуляций клеток
- измерение параметров редко встречающихся клеток
- объективное измерение интенсивности флуоресценции
Область применения
Иммунология
- иммунофенотипирование клеток периферической крови
- определение фагоцитарной активности
- определение внутриклеточных цитокинов
- определение внутриклеточных белков, например транскрипционных факторов GATA-3, T-bet, FoxP3 для дискриминации CD4 Т-лимфоцитов
- определение пролиферативной активности
- исследование клеточного цикла
- оценка клеточной цитотоксичности
Онкология
- количественный анализ внутриклеточных компонентов
- анализ стадий клеточного цикла
- выявление анеуплоидного клона
- определение пролиферативной активности анеуплоидного клона
- определение специфических маркеров
- позволяет проводить наблюдение пациентов, входящих в группу риска
- оценка состояния иммунной системы:
- оценка клеточного звена иммунитета
- оценка функциональной состоятельности иммунокомпетентных клеток
Цитология
- определение цитоморфологической принадлежности клетки размер, соотношение ядро/цитоплазма, степень асимметричности и гранулярности клеток
- оценка активности внутриклеточных ферментов с помощью флуорогенных субстратов
- определение экспрессии поверхностных антигенов
- анализ стадий клеточного цикла
- измерение физиологических параметров клетки
Гематология
- анализ субпопуляционного состава клеток периферической крови
- подсчет ретикулоцитов, анализ тромбоцитов по специфическим маркерам
- дифференциальная диагностика лимфопролиферативных заболеваний и реактивных лимфоцитозов
- диагностика лимфопролиферативных заболеваний
- диагностика острых лейкозов
- оценка минимальной резидуальной болезни
Фармакология
- измерение экспрессии маркеров
- измерение активности внутриклеточных ферментов
- определений стадий клеточного цикла в рамках изучения механизмов воздействия различных биологически активных веществ на клеточном уровне
В настоящее время проточная цитометрия применяется для выявления определённых клеток в исследуемых образцах, определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам, а также мониторирования состояния вирусного процесса у ВИЧ-инфицированных пациентов.
Выявление бактериальных, грибковых, а также собственных клеток организма в биологических жидкостях крайне важно для диагностики многих заболеваний. В ходе одного из исследований было показано, что проточная цитометрия обладает в 100—1000 раз более высокой чувствительностью по сравнению с микроскопией и позволяет выявлять бактериальные клетки в количестве 10-100 в 1 мл крови. При более низкой концентрации бактерий в образце возможно проведение предварительной инкубации. Высокую чувствительность методу придает использование моноклональных антител, помеченных флуоресцирующим веществом.
Проточная цитометрия позволяет не только выявлять инфицирование микроорганизмами, но и определять спектр их чувствительности, причём, длительность исследования не превышает нескольких часов. Подвергнутые воздействию антибиотиков микроорганизмы сравнивают с контрольными образцами того же штамма для установления их жизнеспособности, а также изменений в нуклеиновых кислотах, белках, оболочке клеток и т. п., что позволяет оценить как степень эффекта антибиотика, так и точку приложения его действия.
Ещё одной областью применения проточной цитометрии является мониторирование состояния вирусного процесса у ВИЧ-инфицированных лиц путём определения абсолютного количества CD4+ клеток и их доли в популяции лимфоцитов. Методика может также использоваться для контроля эффективности проводимой терапии.
Просмотров: 12078
|