Биология - Allium test - Методика проведения тестирования

14 мая 2011


Оглавление:
1. Allium test
2. История метода «Allium Test», преимущества перед другими методами и перспективы
3. Преимущества метода Allium cepa
4. Характеристика лука Allium cepa L., применимость в тестах
5. Методика проведения тестирования
6. Макроскопические исследования
7. Микроскопические исследования и статистическая обработка
8. Статистическая обработка данных



Подготовка оборудования для тестирования

Аппаратура и материалы

чашки Петри, цилиндры мерные, пенициллиновые флаконы или аналогичные ёмкости на 20 мл с глубоким дном, стёкла предметные и покровные, бюксы, пипетки мерные, пипетки глазные, лупы стереоскопические МБС-9, микроскопы.

Химические реактивы

Ацетоорсеин
2 %
1 г орсеина растворяют в 50 мл горячей уксусной кислоты, доводят до кипения и фильтруют. Используется для окраски корешков
Фиксатор Кларка смесь 96 % этилового спирта и ледяной уксусной кислоты в соотношении 3:1. Используется для фиксации корешков.
Спирт
70 %
смесь 96 % этилового спирта и дистиллированной воды. Используется для долговременного хранения корешков
Уксусная кислота
40-45 %
смесь ледяной уксусной кислоты и дистиллированной воды. Используется для приготовления препаратов

Подготовка материала для тестирования

Подготовка луковиц

Выберите луковицы для исследования. Выборка должна быть однородной как в контрольном, так и в опытном вариантах опыта. Средняя масса севка — 10-20г, диаметром 1,5-2 см. Выбранные луковицы не должны быть пересушены. Это можно понять сняв лишнюю шелуху, которая так же может мешать и проведению опыта. До начала эксперимента у луковиц не должно быть проклюнувшихся зеленых ростков листьев.

Подготовка фактора мутагенеза и процедура тестирования

Существует два варианта Allium test: оригинальный и модифицированный:

  • В оригинальном варианте теста луковицы помещают для проращивания корешков в чистую воду. По достижении корешками 1-2 см луковицы переносят в ёмкости с исследуемым раствором на определенное время. Оригинальный вариант наиболее удобен при тестировании физических факторов.
  • В модифицированном варианте теста луковицы помещают непосредственно в исследуемый раствор без предварительного проращивания корешков. Данный вариант чаще используется при тестировании химических веществ.

Для тестирования подходят факторы различной природы:

Физический фактор:
  • Радиация
  • Ультрафиолетовое излучение
  • Инфракрасное излучение:
    • Температура
  • Радиоизлучение:
    • УВЧ излучение. В частности излучение GSM диапазона сотовых телефонов
В случае с физическим мутагенным фактором луковицы подвергаются воздействию фактора с прочими одинаковыми условиям среды, как в контроле
Химический фактор:
  • Различные химические соединения или растворы веществ.
    • Растворы различных солей: лития, бериллия, натрия, калия, хрома, железа, кобальта, никеля меди, мышьяка, рубидия, иттрия, палладия, кадмия, бария, лантана, неодима, эрбия, церия, золота, ртути, таллия, свинца, висьмута, тория
    • Allium test предложен для тестирования наночастиц,
    • Фармацевтических и лекарственных препаратов
    • Некоторых красителей
    • Пестицидов
  • Природных и антропогенных сред:
    • Природные воды
    • Промышленные выбросы/сточные воды
В случае с химическим мутагенным фактором луковицы проращиваются на растворе или концентрированном растворе химического вещества и воды в заведомо определённой концентрации. Контроль проращивается на воде без добавления химического мутагенного фактора
Биологический фактор:
  • Продукты жизнедеятельности организмов
    • Биотоксины
    • Гормоны
Аналогично предыдущему

Для чистоты эксперимента допустимо использование дистиллированной воды. При этом луковица будет расти за счёт внутренних питательных резервов. Ограничение тут в том, что дистиллированная вода является мутагеном. Однако и в контроле, и в опыте в этом случае ущерб от дистиллированной воды будем считать равным, как и прочие фоновые условия.
Луковицы проращиваются от 3 до 4 дней. Желательно использовать ёмкости диаметром 1,5 см и высотой 10 см, чтобы по мере роста корни не упирались в дно ёмкости, в которой они находятся. Иначе это может приводить к некоторым биологическим эффектам — реакция меристемы на препятствие. Для проведения ана-телофазного анализа берут часть корешка длиной около 1 см. Проводят процедуру фиксации. При необходимости корешки отмывают от фиксатора в воде, затем окрашивают ацеторсеином согласно стандартной методике. Для микроскопирования используют кончик корня длиной 1-2 мм — зона активного деления меристематических клеток.

Обработка материала после проведения эксперимента

Фиксация

Для фиксации корешки помещают в ёмкости с фиксатором Кларка. Ёмкости герметично закрывают и оставляют для фиксации клеток на 1-2 дня. Затем материал промывают два раза от фиксатора в 70 % спирте, и помещают в ёмкости с 70 % спиртом для долговременного хранения. Спирт должен превосходить материал по объему в 4-5 раз.

Окрашивание материала

Окраску корешков производят 2 % ацетоорсеином. Корешки отмывают от спирта в воде. Материал переносят в небольшие фарфоровые тигли с держателем, которые на 2/3 заполняют красителем. Тигель накрывают предметным стеклом. Нагревают над пламенем спиртов до тайного кипения. Тигель с материалом оставляют на некоторое время для прокрашивания хромосом. После этого можно готовить препараты для микроскопирования.

Методика приготовления препаратов для микроскопического анализа

Готовят временные давленые препараты корневых меристем. Для этого от окрашенного корешка лезвием отрезают кончик меристемы длинной 2-3 мм, помещают на предметное стекло в каплю 45 % уксусной кислоты, накрывают покровным стеклом и с помощью спички аккуратно раздавливают до получения монослоя клеток. Препараты анализируют под микроскопом при увеличении 12,5х1,5х40. На препаратах рассматривают мелкие, округло-квадратной формы клетки с хорошо прокрашенными ядрами и неповрежденными клеточными стенками.



Просмотров: 21068


<<< Модельные организмы
Caenorhabditis elegans >>>