Биология

Биология - Вектор (биология)

16 апреля 2011

Вектор — молекула нуклеиновой кислоты, чаще всего ДНК, используемая в генетической инженерии для передачи генетического материала другой клетке.

Существующие векторы:

• плазмиды
• фагмиды
• векторы на основе вируса SV40
• векторы на основе аденовирусов
• векторы на основе герпесвирусов
• векторы на основе ретровирусов
• векторы на основе аденоассоциированного вируса

Пример клонирования ДНК

В качестве примера рассмотрим процесс клонирования участка чужеродной ДНК бактерией E. coli при помощи плазмиды pBR322.

pBR322 — искусственная плазмида, созданная Франциско Боливаром и Раймондом Родригесом с целью клонирования генетического материала. Она представляет собой циклический фрагмент ДНК длиной 4361 нуклеотидных пары. Плазмида содержит ген устойчивости к тетрациклину tet, взятый из естественной плазмиды pSC 101; ген устойчивости к ампициллину amp, взятый из транспозона Tn3; и участок начала репликации ori, заимствованный из плазмиды pMB 1. Тетрациклин и ампициллин — сильные антибиотики. Наличие в плазмиде генов устойчивости к ним играет существенную роль в выделении бактерий со встроенным участком чужеродной ДНК. Плазмида содержит также сайты рестрикции Pst I, Bam HI и Sal I, причём первый находится в гене amp, а два остальных — в гене tet. Это важное обстоятельство помогает модифицировать плазмиду.

Предположим, что в плазмиду необходимо встроить фрагмент, который ранее был вырезан из другой ДНК рестриктазой Bam HI. Для этого плазмиды обрабатываются рестриктазой Bam HI, и добавляются участки чужеродной ДНК. Поскольку на концах всех фрагментов ДНК находятся комплементарные последовательности нуклеотидов, они начнут «склеиваться», причём возможны два варианта склейки :

• Соединятся концы линейной плазмиды pBR 322, образовав исходную кольцевую плазмиду.
• Между концами линейной плазмиды pBR 322 вклинится участок чужеродной ДНК, образовав кольцевую плазмиду со встроенным фрагментом.

Поскольку плазмиды со встроенным фрагментом являются целью процесса, необходимо выделить такие плазмиды и клонировать их. Процесс идёт следующим образом:

1. Плазмиды внедряются в клетки E. coli. Для этого клетки обрабатываются ионами Ca, что делает их мембраны проницаемыми для ДНК.
2. Полученные бактерии высевают на среду, содержащую ампициллин. В этой среде нормально растут колонии бактерий, содержащие плазмиды, остальные колонии угнетаются. По этому признаку можно отличить бактерии, содержащие плазмиды;
3. Колонии, содержащие плазмиды, перепечатываются на среду, содержащую тетрациклин. Поскольку чужеродная ДНК вклинивается внутрь гена tet, дезактивируя его, колонии бактерий с модифицированными плазмидами угнетаются тетрациклином. Таким образом они визуально отличимы от колоний бактерий с восстановленными плазмидами.
4. В результате этих действий выделяются колонии E. coli, в плазмиды которых встроен участок чужеродной ДНК. Они высеваются в обычную среду для дальнейшего клонирования.

Процедуру клонирования можно также вести с помощью рестриктаз Sal I и Pst I. В первом случае процесс будет аналогичен, в последнем бактерии с модифицированными плазмидами будут, наоброт, чувствительны к ампициллину и нечувствительны к тетрациклину.

Просмотров: 8565

<<< Блоттинг

Вестерн блоттинг >>>