Биология - Вестерн блоттинг - Гель-электрофорез
09 февраля 2011Оглавление:
1. Вестерн блоттинг
2. Подготовка образца
3. Гель-электрофорез
4. Перенос на мембрану
5. Блокирование
6. Детекция
7. Анализ
8. Протоколы
Белки разделяются при помощи электрофореза в полиакриламидном геле. Разделение белков можно производить по изоэлектрической точке, молекулярной массе, электрическому заряду или по сочетанию этих параметров.
Наиболее распространенный способ разделения белков — электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия по Лэммли. SDS вызывает денатурацию белков и поддерживает их в денатурированном состоянии, для разрушения вторичных и третичных структур белков используют восстановители дисульфидных связей, например, дитиотреитол и меркаптоэтанол. Денатурированные полипептиды мигрируют в электрическом поле через акриламидный гель к аноду, при этом белки меньшего размера двигаются быстрее и, таким образом, разделяются в соответствии с молекулярной массой. Концентрация акриламида определяет разрешающую способность геля — чем выше концентрация акриламида, тем лучше разрешение низкомолекулярных белков. Низкая концентрация акриламида улучшает разрешающую способность для высокомолекулярных белков. Также возможно использование двухмерного электрофореза. В таком случае разделение белков производят в двух направлениях — в соответствии с их изоэлектрической точкой в первом направлении, и в соответствии с молекулярной массой — во втором.
Образцы на гель наносят в карманы. Как правило, одну из «дорожек» оставляют для маркеров молекулярной массы. После подачи напряжения белки двигаются в электрическом поле с различной скоростью. Отличия в скорости продвижения — электрофоретической подвижности приводит к разделению белков на полосы.
Просмотров: 20428
|
|