Биология - Трансфекция - Трансфекция стабильная и транзиентная
08 февраля 2011Оглавление:
1. Трансфекция
2. Методы трансфекции
3. Трансфекция стабильная и транзиентная
Нередко для решения поставленной задачи достаточно ввести ДНК в клетки лишь на какое-то время, достаточное для ее экспрессии. Т.к. трансфицированная ДНК обычно не включается в ядерный геном и не реплицируется, чужеродная ДНК быстро теряется по мере размножения клеток. Такая трансфекция называется транзиентной.
Если необходимо закрепить введенный ген и в потомстве трансфицированых клеток, то его следует включить в ядерный геном. Такая трансфекция называется стабильной. Для этого в клетки вводят еще один ген, который облегчает селекцию трансфицированных клеток и поэтому именуется маркером селекции. Например, маркером селекции может быть ген резистентности к некоторому антибиотику. Некоторые клетки совершенно случайно включают чужеродную ДНК в свой геном, и задача в таком случае, состоит лишь в том, чтобы отобрать потомство таких клеток, что несложно сделать в присутствии антибиотика, губительного для всех клеток кроме трансфицированных.
В качестве антибиотиков, применяемых для селекции трансфицированных клеток, часто применяют генетицин, известный также как G418, пуромицин, доксимицин и др.
Встраивание чужеродной ДНК в клеточный геном происходит благодаря наличию в клетке механизма репарации. Поэтому эффективность встраивания увеличивается, если вводимая в клетки ДНК является линейной, а не кольцевой, какими обычно бывают бактериальные плазмиды. Конечно, наличие в клетках рестриктаз в какой-то мере обеспечивает случайную линеаризацию кольцевых плазмид, но она может происходить и по гену селекции или гену, который должен быть встроен в геном. Поэтому обычно при подготовке стабильной трансфекции генноинженерные конструкции предварительно линеаризуют.
Еще большей подготовительной работы требует встраивание гена в определенное место в геноме, что требуется, например, для генетического нокаута. В таком случае в геннноинженерной конструкции кассета вводимых в хромосому генов должна находиться между двух участков, комплементарных хромосомной ДНК, длиной 1000-3000 пар нуклеотидов.
Просмотров: 14972
|
|