Биология - Пиросеквенирование

09 февраля 2011


Оглавление:
1. Пиросеквенирование
2. Коммерциализация



Пример пирограммы, которую отображает прибор по завершении сеанса пиросеквенирования

Пиросеквенирование это метод секвенирования ДНК, основанный на принципе «секвенирование путем синтеза». При включении нуклеотида происходит детекция высвобождающихся пирофосфатов. Технология была разработана Полом Ниреном и его студентом Мустафой Ронаги, в Королевском Техническом Институте в 1996 году.

Процедура

"Секвенирование путем синтеза" заключается в том, что для секвенирования одноцепочечной ДНК ферментативно синтезируют комплементарную цепочку. Метод пиросеквенирования основан на детекции активности фермента ДНК-полимеразы с другим хемилюминесцентным ферментом. Метод позволяет секвенировать одну цепочку нуклеотидов ДНК путем синтеза комплементарной цепочки, при этом регистрируется присоединение каждого нуклеотида. Матрица ДНК иммобилизована, растворы нуклеотидов A, C, G и T добавляются и отмываются последовательно после реакции. Свет образуется в тот момент, когда раствор нуклеотидов соответствует первому неспаренному основанию матрицы. Последовательность растворов, которые дают хемилюминесцентный сигнал, позволяет определить последовательность матрицы.

Матрица одноцепочечной ДНК гибридизуется с праймером и инкубируется с ферментами ДНК-полимеразой, АТФ-сульфурилазой, люциферазой и апиразой, а также с субстратами аденозин-5´-фосфосульфатами и люциферином.

  1. Добавление одного из четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов инициирует следующий этап. ДНК-полимераза включает правильный комплементарный дезокси-нуклеотид в цепочку. При этом стехиометрически высвобождается пирофосфат.
  2. Фермент АТФ-сульфурилаза количественно превращает PPi в аденозинтрифосфат в присутствии аденозин-5´-фосфосульфата. АТФ выступает "топливом" для фермента люциферазы, которая превращает люциферин в оксилюциферин, при этом высвобождается видимый свет, интенсивность которого пропорциональна количеству образовавшегося АТФ, Свет образуется в реакции, катализируемой люциферазой, регистрируется камерой и далее анализируется специальной компьютерной программой.
  3. Невключенные нуклеотиды и АТФ подвергаются деградации ферментом апиразой, и реакция начинается с новым нуклеотидом.

В настоящий момент, существуют некоторые ограничения в применения данного способа секвенирования. Лимитирующим фактором является длина последовательности нуклеотидов, которая составляет около 300-500 нуклеотидов, что короче, чем 800-1000 нуклеотидов, достижимые методом обрыва цепи. Такие ограничения могут затруднять секвенирование геномов, в частности, богатых повторенными последовательностями нуклеотидов. К 2007 году, пиросеквенирование обычно использовали для повторного секвенирования или секвенирования геномов, для которых известна последовательность нуклеотидов родственного вида.



Просмотров: 9145


<<< Метод Эдмана
Секвенирование >>>