Биология

Биология - Капиллярный электрофорез - Способы разделения

Молекулы разделяют капиллярным электрофорезом из-за отличий в подвижности в приложенном электрическом поле. Скорость движения разделяемых молекул в приложенном поле относительно электрода с противоположным зарядом:

где μ_p это электрофоретическая подвижность и E — сила электрического поля. Электрофоретическая подвижность пропорциональна заряду иона. В случае, когда образец состоит из двух типов молекул, отличающихся зарядом, в результате электрофореза происходит разделение. Электрофоретическая подвижность вещества при данных значениях рН составляет:

где z это удельный заряд молекулы и r это радиус Стокса молекулы:

где k_B это постоянная Больцмана, и T температура, а D — коэффициент диффузии. Данные уравнения показывают, что электрофоретическая подвижность молекулы пропорциональна заряду и обратно пропорциональна ее радиусу. Электрофоретическая подвижность может быть определена экспериментально по времени движения молекулы в электрическом поле заданной силы:

где L это расстояние от точки старта до места детекции, t_r это время, затраченное анализируемой молекулой на достижение точки детекции, V напряжение электрического поля, и L_t это общая длина капилляра. Так как электрическое поле действует лишь на заряженные молекулы, незаряженные молекулы слабо разделяются капиллярным электрофорезом.

Скорость перемещения анализируемых молекул при капиллярном электрофорезе зависит от величины электроосмотическго потока в буфере. В общем случае электроосмотический поток направлен по направлению к отрицательно заряженному катоду. Отличающиеся электрофоретическими подвижностями, молекулы двигаются к противоположно заряженному электроду. Отрицательно заряженные частицы двигаются к положительно заряженному аноду, положительно заряженные -- к катоду в направлении электроосмотического потока.

Рисунок 3: Разделение заряженных и незаряженных молекул в соответствии с их электрофоретической и электроосмотической подвижностью

Скорость электроосмотического потока u_o может быть представлена в виде:

u_o = μ_oE

где μ_o это электроосмотическая подвижность, равная:

где ζ это потенциал стенки капилляра, а ε относительная диэлектрическая проницаемость буферного раствора. Электроосмотическая подвижность может быть определена путем измерения времени задержки нейтрально заряженных молекул. Скорость движения анализируемой молекулы в электрическом поле может быть представлено в виде:

u_p + u_o =E

Ввиду того, что электроосмотический поток буферного раствора обычно больше, чем электрофоретический поток анализируемых веществ, все анализируемые молекулы перемещаются с буферным раствором к катоду. Отрицательно заряженные молекулы дольше задерживаются в капилляре, ввиду противоречий в их электрофоретических подвижностях. Порядок перемещения заряженных молекул представлен на рисунке 3: небольшие катионы перемещаются быстро, малые многократно заряженые анионы сильно задерживаются.

Рисунок 4: Схема внутренней организации капилляра, заполненного силикагелем в присутствии буферного раствора