Биология

Биология - Флюоресцентная гибридизация in situ - Зонды

Клетки мочеиспускательного канала, гибридизованные четырьмя различными зондами

Зонды для флюоресцентной гибридизации in situ часто делают из фрагментов ДНК, выделенных, очищенных и амплифицированных для использования в проекте Геном человека.

Подготовка и гибридизация

Схема эксперимента по флюоресцентной гибридизации in situ для локализации положения гена в ядре

На первом этапе происходит конструирование зондов. Размер зонда должен быть достаточно большим для того, чтобы гибридизация происходила по специфическому сайту, но и не слишком большой, чтобы не препятствовать процессу гибридизации. Зонд непосредственно маркируется флюорофором, либо мишенями для флюоресцентно меченных антител. Мечение зонда может осуществляться разными способами, например, путем ник-трансляции или при помощи ПЦР с меченными нуклеотидами.

На следующем этапе делают препараты интерфазных или метафазных хромосом. Хромосомы прочно прикрепляют к субстрату, как правило, стеклу. Повторяющиеся последовательности ДНК должны быть заблокированы короткими участками ДНК. Добавляют зонды и осуществляют гибридизацию в течение порядка 12 часов. Несколько стадий отмывки удаляют все негибридизовавшиеся зонды. Получившиеся препараты визуализируют и производят количественный анализ при помощи микроскопа.

Интенсивность флюоресцентного сигнала зависит от многих факторов — эффективности мечения зондом, типа зонда и типа флюоресцентного красителя. Эксперименты по FISH могут выявлять или локализовать экспрессию генов в клетках и тканях при помощи репортерных генов, например, экспрессирующих зеленый флюоресцентный белок.