Биология - Электрофорез белков в полиакриламидном геле - SDS-PAGE по Лэммли

09 февраля 2011


Оглавление:
1. Электрофорез белков в полиакриламидном геле
2. SDS-PAGE по Лэммли
3. Визуализация продуктов разделения



В 1970 году Лэммли для изучения процесса сборки капсида бактериофага Т4 предложил метод электрофоретического разделения белков в полиакриламидном геле в зависимости от молекулярной массы . Для этого перед нанесением на гель образцы кипятили в присутствии додецилсульфата натрия и 2-меркаптоэтанола. Под воздействием 2-меркаптоэтанола происходит восстановление дисульфидных связей, что предотвращает выпетливание денатурированных полипептидов и повышение их подвижности. SDS является сильным детергентом, его молекула состоит из двенадцатичленной алифатической неразветвленной цепи и ковалентно связанного с ним сульфата, имеющего в растворе отрицательный заряд.

При использовании описываемого метода исходят из следующих допущений:

  • белки после обработки SDS находятся в полностью денатурированном состоянии;
  • количество молекул SDS, связанных с полипептидом, пропорционально его длине, и, следовательно, молекулярной массе;
  • собственный заряд полипептида несущественен в сравнении с зарядом связанного с ним SDS.

В данных условиях, все полипептиды имеют одинаковый удельный заряд и разделяются обратно пропорционально логарифму их молекулярной массы. Практика подтверждает верность данных предположений в подавляющем большинстве случаев.

Для проведения денатуририрующего электрофореза в ПААГ используются различные буферные системы. Наиболее распространённая система, которая подразумевается по умолчанию — это буферная система Лэммли. Кроме того, в подавляющем числе работ используют, так называемый, disc-электрофорез то есть используют гель, состоящий из двух частей. Концентрирующий гель имеет pH 6,5 и концентрацию полиакриламида около 4 %. Разделяющий гель имеет рН в районе 8,5-9 и концентрацию полиакриламида 10-20 %. Все буферы не содержат неорганических солей, основным переносчиком тока в них является глицин. При рН 6,5 суммарный заряд молекулы глицина близок к нулю. Вследствие этого для переноса определенного заряда, отрицательно заряженные комплексы полипептидов с SDS должны двигаться с большой скоростью. При рН 8,8 глицин приобретает отрицательный заряд, вследствие чего на границе концентрирующего и разделяющего гелей белки резко тормозятся. Результатом этого является концентрирование белков на границе гелей, что очень сильно повышает разрешающую способность метода.

В разделяющем геле белки мигрируют в зависимости от длины полипептидной цепи, то есть обратно пропорционально молекулярной массе.



Просмотров: 13010


<<< Электрофорез белков
Электрофорез в полиакриламидном геле >>>