Биология - Долговременный эксперимент по эволюции E. coli - Методика эксперимента

21 мая 2011


Оглавление:
1. Долговременный эксперимент по эволюции E. coli
2. Методика эксперимента
3. Результаты эксперимента



Выбор бактерии E. coli объясняется быстрой сменой поколений у этого организма и небольшим размером генома, что позволяет за короткий период времени исследовать процессы, которые у более сложных организмов занимают тысячелетия. Благодаря тому, что эта бактерия десятилетиями используется в молекулярной биологии, она хорошо исследована, технологии работы с ней хорошо отлажены. Бактерия без потери жизнеспособности может длительно сохраняться в замороженном состоянии, что позволяет вести своеобразную «летопись эксперимента», а размораживание нужного поколения позволит при необходимости повторить эксперимент с любой ранее сохранённой точки.

В качестве предкового штамма E. coli был взят «штамм Bc251», описанный в 1966 году Сеймуром Ледербергом русск. и использованный Брюсом Левиным русск. в экспериментах по бактериологической экологии в 1972 году. Характерными чертами этого штамма были T6, Str, rm, Ara. Перед началом эксперимента путём точечной мутации оперона ara Ленски подготовил Ara вариант этого штамма, способный усваивать арабинозу.

В начале эксперимента были созданы 12 популяций исходного штамма. Для точной идентификации каждой популяции были задействованы генетические маркеры. Каждая популяция размножалась в искусственной среде, где скорость размножения ограничивалась стрессовыми условиями. Каждый день 0,1 мл содержимого каждой пробирки переносилось в пробирку с 10 мл свежей питательной среды, где размножение бактерий продолжалось. Каждое 500-е поколение замораживалось в глицерине при температуре -80 °С, чтобы в будущем с появлением новых методов анализа имелась возможность провести более подробное исследование. По ходу эксперимента полностью секвенировался геном предкового штамма, а также геномы некоторых этапных поколений.

Поскольку размер генома E. coli составляет 4,6 млн нуклеотидных пар, то при наблюдаемой скорости мутаций, каждая пара нуклеотидов в геноме за 20 лет заменяется в среднем более одного раза. Не все мутации, возникающие в геноме, равнозначны. Полезность мутации определяется скоростью размножения их носителей. Повышенная скорость размножения позволяет мутировавшей бактерии вытеснять из популяции бактерии с отсутствующей мутацией. При этом мутация «фиксируется» и присутствует в геноме всех последующих поколений. Вредные мутации действуют противоположным образом. Существуют также «нейтральные» мутации, которые не влияют на скорость размножения бактерий, так как возникают в незначимых участках генома. Эти мутации не фиксируются и не подавляются отбором и, таким образом, появляются и исчезают случайным образом.

В эксперименте использовалась линия E. coli, размножающаяся исключительно делением. Таким образом, круг исследуемых явлений ограничивался вновь возникшими мутациями.

Питательная среда DM25

В эксперименте использовалась минимальная питательная среда Дэвиса с концентрацией глюкозы 25 мг/л, обозначаемая как DM25. Эта среда обеспечивает в стационарной фазе плотность 50 млн бактерий/мл.

Объём культуры составлял 10 мл. Культуры содержались в 50-мл конических колбах, свободно накрытых перевёрнутыми стеклянными стаканами. Инкубация происходила при температуре 37 °С и скорости вращения 120 об/мин. По прошествии суток 0,1 мл культуры переносился в колбу с 9,9 мл свежей среды.

Состав среды DM25 следующий:

Компонент Формула Объём Масса Приготовление
Гидрофосфат калия K2HPO4 · 3H2O 3,5 г Приготовить раствор и автоклавировать
Дигидрофосфат калия KH2PO4 · H2O 1,0 г
Сульфат аммония 2SO4 0,5 г
Цитрат натрия Na3C6H5O7 0,25 г
Вода H2O 500 мл
Глюкоза C6H12O6 0,125 мл 12,5 мг После автоклавирования добавить из стерильных флаконов
Сульфат магния MgSO4 0,5 мл 25 мг
Тиамин C12H17N4OS 0,5 мл 25 мг

Следует отметить, что обычно бактерии E. coli не потребляют цитрат натрия, он используется только как хелатор железа.



Просмотров: 9709


<<< ДНК-метилтрансфераза
Зимография >>>